Assassins Creed 2 начинается с момента окончания первой части где, в 2012году, Дезмонду Майлсу, пленник которого организация «Абстерго Индастриз», используют для расшифровки его генетической памяти о Альтаире, его далеком предке из тайного ордена убийц, грозит смерть.
Люди из «Абстерго», являются современными Тамплиерами, цель которых мировое господство, и добится этого они могу с помощью древнего артефакта "Частицы Эдема". Из-за долгого прибывания в Анимусе, на Дезмонде начал проявляться "эффект просачивания", благодаря чему он смог использовать "Орлиное зрение" Альтаира, с помощью которого он стал видеть символы и письмена на стенах его камеры. Люси Стиллман, сотрудник Абстерго, так же является член братства современных ассасинов, помогает Дезмонда бежать и прячет его в секретном укрытии. У них так же имеется "Анимус 2.0" они приглашают Дезмонда помочь им расшифровать его память о другом его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, чтобы найти остальные частицы Эдема.
Все действие Assassins Creed 2 на этот раз разворачивается в Италии, Эпохи Возрождения. Отец Эцио был предан его другом, после чего с братьями приговорен к смертной казни. Эцио удается спрятаться, а после отомстить предателю. Вместе с матерью и сестрой, Эцио скрывается в поместье своего дяди, Марио.
Выясняется, что Марио глава ордена ассасинов, и Эцио не задумываясь вступает в орден, после посвящения Эцио отправляется в Рим, чтобы отомстить тому кто спланировал убийство его семьи, Родриго Борджиа который к тому же недавно стал Папой Римским, который желает получить Частицу Эдема. Эцио удается победить Борджиа, но не убить. Под Римом находится тайная комната куда может попасть только пророк, а пророком оказывается сам Эцио. Некая святящаяся сущность, Минерва, говорит что люди созданы пришельцами, которые давно умерли по неизвестной причине, тоже может случится с Землей и лишь Дезмонд может это предотвратить.
Assassins Creed 2 заканчивается нападением на штаб ассасинов, бойцами «Абстерго».
